灌流培养凭借可连续加入营养成分、及时清除代谢废物、能够在较长周期内维持高细胞密度和高细胞活率从而达到增产效果的优势，目前已被广泛应用于多个临床生产项目。科百特自研自产的0.2μm 中空纤维柱，在N-1灌流培养中表现优良，CHO细胞密度在D7可达60E6 cells/mL，且可维持较高细胞活率。
以上结果表明，科百特上新的ATF中空纤维产品，可进一步赋能灌流工艺，为用户端提供更具性价比的灌流产品。
随着生物医药行业竞争愈发激烈，降低成本、加快上市速度和提升工艺灵活性等问题备受企业关注，而能否提出相应解决方案，则成为生物制药企业未来能否脱颖而出的有效竞争力。
企业都希望基于现有厂房设施不做大改动的情况下，通过应用新技术来实现降低成本与产能提升的效果。灌流细胞培养利用细胞截留装置和连续的培养基置换，在较长的时间内实现并维持较高的细胞密度和活性。细胞截留装置将细胞截留在生物反应器内，同时加入新鲜的培养基，并不断地去除目的产物、废物和营养耗竭的培养基，为细胞生长代谢提供有力的培养环境。由于N-1灌流技术可以快速实现上游工艺强化，是提升表达量与缩短工艺时间的高效方法，目前已被越来越多的生物制药企业应用。
本文将基于现有N-1灌流技术的应用案例，汇总行业内N-1灌流的见解展开描述，并介绍科百特在灌流培养工艺中可提供的产品解决方案。
N-1灌流及优势：
为了减少生物反应器放大阶数，用户端通常利用较小规格的生物反应器制备高密度种子细胞，直接接种于最后一级（即N级）生物反应器，用于生产蛋白或扩增病毒，这种方法称之为高密度N-1策略。N-1灌流是种子扩增强化的一种形式，旨在强化生产生物反应器(N)前一步中细胞生长。该强化工艺可通过在N-1生物反应器上连接一个细胞截留设备（如ATF 设备）得以实现，以获得高细胞密度和活性，从而以更高的起始细胞密度接种生产生物反应器，缩短生产生物反应器的运行时间。这可在无需直接改变核心生产工艺的前提下，显著提高工厂产量。因此，N-1策略可以实现节约种子细胞培养时间和成本，这对生物药企细胞培养工艺开发具有重要意义。
材料和方法：
中空纤维柱(HFF)：Cobetter 0.2μm
反应器：WAVE 25和自产20L WAVE灌流反应袋
ATF2灌流组件：C24 controller
细胞类型：CHO细胞
灌流体系：Basal medium: dynamis Feed: feed C
图1 N-1 灌流培养细胞密度
CHO细胞按0.4E6 cells/mL接种至WAVE反应器中，待细胞密度达到5E6 cells/mL后开启灌流，根据细胞生长情况调整灌流比例进行N-1高密度种子扩培。培养至第7天时，细胞密度达到60E6 cells/mL，整个培养阶段细胞活率都保持在95%以上，细胞生长状态良好。
图2 N-1 灌流培养细胞活力
科百特自产的WAVE 25灌流反应袋内置dip-tube, 并与ATF组件连接。Feed/Basal medium按5%的比例连续泵入10L 培养体系，实现高密度种子N-1灌流培养。在对数生长期内，该培养体系种子密度可满足1000L feed-batch的生产放大。
N-1灌流结论：
相比传统流加培养和N-1种子富集，在同样的培养基和反应器优化策略下，N-1灌流中接种密度的提高是产量提升的主要因素，表达量的显著增加主要是因为较高的VCD和细胞特异性生产力。通过灌流培养，延长细胞指数生长期，从而达到高密度细胞培养。N-1灌流培养的高密度种子可使用1：100的比例接种至生产生物反应器，极大地减少种子罐级数，节约种子链时间，最终达到降低成本的目的。
科百特灌流产品解决方案
中空纤维柱以其独特的开放式流路结构，温和的低剪切力等特点，可较好满足对剪切力敏感的生物大分子以及成分较复杂的生物样品在不同规模下的浓缩和过滤需要。目前已广泛应用于抗体、重组蛋白、病毒类疫苗、核酸、生化药以及乳品饮料等多领域。
科百特自研的中空纤维过滤组件，是由中空纤维封装于聚丙烯外壳而制成。外壳有端头配件，每个端头配件包括两个端口，即一个进样端口、一个回流端口及两个滤液端口。端口可使用不同类型和尺寸的转接头及接头。中空纤维长度与外壳一致，从进样端口流通至回流端口。使用时，在泵的压力作用下将料液从进样端口泵入。大部分料液流动通过中空纤维，从回流端口流出。还有部分料液通过中空纤维壁，进入外壳内，再从滤液端口流出。
目前，科百特中空纤维膜现有明星产品孔径包括：50KD、0.2 µm、 0.45 µm，膜材为mPES，可用于生物样品灌流培养和固液分离等场景。另有 30、60 cm 等不同长度规格，单根滤柱膜面积涵盖 470 cm²- 0.11 m²，可灵活满足不同规模、不同性质料液在不同场景下的应用需求。（见表1）
| 类别 | 膜 | 纤维内径 | 孔径 | 长度 | 膜表面积 |
| mPES | 改性聚醚砜 | 1mm | 50KD, 0.2 µm，0.45 µm |
30cm,60cm | 470 cm²- 0.11 m² |
表1 科百特ATF中空纤维参数表
为提供更完整、高价值的服务，科百特在不久的将来也会陆续上市相应灌流组件，如隔膜，泵壳，ATF控制器等。
产品性能：
- 低生物负载，对培养细胞无毒性
- 100%完整性测试
- 符合使用标准的流路生物相容性及无动物源性特性
- 在灌流模式下可推进细胞生长,提高细胞密度
产品应用：
- 细胞浓缩和澄清
- 裂解液澄清
- 蛋白质纯化和浓缩
- 生物反应器灌流培养和培养基置换
